Nukleinsyresyntesen utføres ved bruk av fastfase sialinamidtriglyseridmetoden, hvor 3'-enden av DNA immobiliseres på et fastfasesubstrat og nukleotider tilsettes i 3'- til 5'-retningen til det ønskede DNA-fragmentet er syntetisert. .Dette skiller seg fra DNA-syntese ved påføring av DNA-polymerase.
3'-enden av den første basen er immobilisert på CPG under syntese, 5'-OH til den neste basen er beskyttet med di-p-tolyl trityl DMT, aminogruppen på basen er beskyttet med benzosyre og 3' -OH aktiveres deretter med en aminofosfatforbindelse.1 base av 5 5'-OH av 1 base og 3'-OH av neste base danner et fosfitt-triglyserid, som deretter oksideres med jod til et fosfat-triglyserid, beskyttelsesmidlet på den andre basen 5'-OH fjernes ved tilsetning av dikloreddiksyre DM sykluser gjennom tilsetning av neste base, og etter syntese fjernes beskyttelsesmidlet på 5'-OH med en svak syre. Fragmentet kobles fra den faste harpiksen med konsentrert ammoniumhydroksid, beskyttelsesmidlet fjernes fra basen med konsentrert ammoniumhydroksid under oppvarming fjernes ammoniumhydroksidet, fragmentet vakuumtørkes og nukleinsyren renses ved væskekromatografi eller PAGE.
Trinn av oligosyntese
Deblokkering
De5-endes DMT-beskyttelsesgruppe fjernes ved å tilsette TCA-løsning.
Aktivering
Blanding av aktivatoren med oligonukleotidmonomeren for å danne det aktive oligonukleotidmonomermellomproduktet.
Kobling
Den 5-terminale hydroksylgruppen reagerer med det aktive oligonukleotidmellomproduktet i en antigenerativ kondensasjonsreaksjon for å danne en ustabil fosfitt-triglyseridbinding.
Capping
Tilsetningen av et dekkemiddel utfører en acetyleringsdekningsreaksjon med overskytende hydroksylgrupper som ikke er involvert i kondensasjonsreaksjonen.
Oksidasjon
Tilsetning av jodløsning som inneholder vann reagerer med ustabile fosfittbindinger ved oksidasjon for å danne stabile fosforsyretriglyseridbindinger.
Cyanoetyl-spaltning
Nukleinsyreproduktet etter syntese, med tilsetning av DEA-løsning for å fjerne cyanoetylgruppen fra fosfat-triglyseridbindingen.
Spaltet og avbeskyttelse
Nukleinsyrefragmentene spaltes fra fastfasebæreren ved å tilsette en konsentrert ammoniumhydroksidløsning og deretter varmes opp for å fjerne beskyttelsesgruppene fra hydrogenbindingene til basene.
Innleggstid: 21. november 2022